自然杀伤(natural killer,NK)细胞是人体第三类淋巴细胞,是天然免疫的核心细胞,约占淋巴细胞循环数的5%-15%,其表面缺少T细胞和B细胞的特异性标志如TCR和Smlg。研究发现,NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生,能够识别靶细胞、杀伤介质。与其他抗癌免疫细胞相比,NK细胞杀灭肿瘤和病毒感染细胞的作用更强、更有效,其激活不依赖于肿瘤细胞表面抗原,也不需要像T细胞一样,要经过免疫系统的抗原辨识反应才确定“攻击”目标。NK细胞在全身血管行使免疫监视功能,能在第一时间发现并启动免疫防御功能,迅速杀死病变、癌变的细胞,被医学界公认为抗癌第一道防线。NK细胞治疗在癌症治疗领域发展迅速,特别是用于治疗血液瘤,NK细胞对肿瘤细胞有天然的识别,它的激活受激活型和抑制型NK细胞受体信号传导的平衡调节。同时,除了能识别肿瘤细胞以外,NK细胞还能够杀伤细菌、病毒等微生物侵染的细胞。目前,使用外周血、脐带血和多能干细胞衍生的NK细胞治疗性恶性肿瘤等临床试验都在陆续开展中。外周血来源NK细胞容易获得,但转染效率低。脐血来源的NK细胞具有更强大的增殖能力,但脐血来源NK细胞杀伤能力比外周血来源NK细胞低。NK细胞过继性免疫疗法主要包括两类:一类是自体或是同种异体NK细胞输注,另一类是CAR-NK细胞疗法。其中自体或是同种异体NK细胞过继传输,是将外周血来源、干细胞来源以及iPSC诱导来源NK细胞转输到患者体内,增加患者体内NK细胞数量和活性。而CAR-NK细胞疗法采用与CAR-T细胞类似的方式修饰NK细胞,增强细胞靶向起到提高肿瘤抑制的效率。
图1:多个来源的异体NK细胞分离、活化和增殖的方法。
人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)来源的NK标准化、肿瘤杀伤性能优越、耐冻存复苏、便于多元件基因修饰等优势,规避了细胞治疗中其他来源的NK细胞和T细胞所遇到的许多挑战,且hiPSCs可以通过自我更新,在未分化状态下实现无限生长。因此,从hiPSCs中提取NK细胞,能在同一细胞系中产生无限数量的NK细胞,实现标准化生产。利用iPSCs获得的细胞产品也可以通过全基因组测序实现单克隆分离和脱靶基因组改变。此外还能有效地添加多种遗传信息改变来增强NK细胞的活性。包括转座子系统和慢病毒递送,CRISPR/Cas9基因编辑技术等,经改造后的hiPSCs可以经冷冻和储存后,可用于生产标准化的NK细胞。与外周血和脐带血来源的NK细胞一样,hiPSC来源的NK细胞对多种靶细胞表现出细胞毒性,通过裂解颗粒释放穿透素和颗粒酶,产生促炎细胞因子干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α),以及通过与TRAIL和Fas-FasL相互作用介导肿瘤细胞凋亡。目前对hiPSC的基因工程改造,以创造具有增强扩增、体内持久性和肿瘤杀伤等能力的hiPSC-NK细胞,改造后鉴定筛选出稳定的hiPSC,就可以将其扩增并用于生产标准化的hiPSC来源的NK细胞,这里列举了部分可以增强hiPSC-NK细胞的扩增和功能的研究方向(图2):
图2:通过基因修饰改良iPSC-NK的方法,包括异位表达IL-15或其他细胞因子、CAR增强抗肿瘤细胞毒性、重组CD16和敲除特定基因(如CISH)等。
IL-15在刺激NK细胞扩增和细胞毒功能方面发挥重要作用。IL-15的激活也被证明可以减轻由TME释放的转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1介导的免疫抑制。调控IL-15表达可以增强各种NK细胞群的抗肿瘤活性,而不需要用高剂量的细胞因子补充细胞生产培养。各种激活IL-15信号通路的方法已被证明可以用于改善NK细胞的生物学功能。IL-15与抗CD19 CAR联合表达可改善CB来源的NK细胞对体外表达CD19的细胞系和原发性白血病细胞的细胞毒性,并显着延长Raji淋巴瘤异种移植模型的生存期。NK细胞活性受多种免疫细胞的相互作用调节,包括但不限于T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和骨髓基质细胞。这些细胞分泌多种细胞因子和趋化因子,与NK细胞上的特定受体结合。这些细胞因子受体包括IL-2R、IL-12R、IL-15R、IL-18R和IL-21R。除了改善NK细胞功能的策略外,现在已经使用多种方法来改善NK细胞靶向更多NK细胞抗性肿瘤。本节描述了其中的一些策略,包括向NK细胞添加CAR,修饰NK细胞上的Fc受体,使用免疫检查点抑制剂抗体和NK细胞接合分子。CAR是一种工程化的细胞表面受体构建物,通过识别肿瘤细胞表面的靶抗原来指导免疫细胞的功能,从而通过细胞内信号传导域激活免疫效应细胞。CAR构建体通常包含三个主要成分:用于识别靶抗原(结合物)的外结构域、跨膜结构域(transmembrane domain,TM)和细胞内信号传导内结构域。外结构域通常是一种免疫球蛋白样单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv),赋予针对目标肿瘤的抗原特异性。例如,靶向CD19治疗B细胞白血病和淋巴瘤的scFvs现在被用于FDA批准的CAR-T细胞。靶向间皮素、表皮生长因子受体、前列腺特异性膜抗原或其他肿瘤抗原的结合物已经开发出来,并在临床试验中用于治疗各种恶性肿瘤。NK细胞表达活化免疫球蛋白γ Fc受体CD16a,该受体识别与靶标结合的IgG抗体的Fc区。CD16a结合提供了激活NK细胞的有效刺激。单克隆抗体治疗的临床抗肿瘤活性部分依赖于NK细胞ADCC活性。通过基因修饰,CD16a上的ADAM17切割位点可以发生突变,从而阻止CD16a脱落并增加ADCC。在iPSC-NK细胞中,具有高亲和力F158V突变的CD16分子(称为hnCD16)可以抵抗ADAM17的切割,维持CD16a表面表达,并与抗癌单克隆抗体联合使用时显示出增加的细胞毒性和细胞因子的产生。第二种Fc受体CD64与CD16A结合相同的IgG1和IgG3亚型,其亲和力比CD16A高30倍以上。CD64通常只在髓细胞上表达,而在NK细胞上不表达。CD64的高亲和力允许单克隆抗体预先吸附到表达重组CD64的NK细胞上,并且无需额外使用抗体即可改善肿瘤靶向性。CAR-T细胞在复发或难治性B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤取得了一些成果,针对其他肿瘤类型的研究正在进行中。然而,目前的CAR-T治疗策略存在一些安全性和使用限制,这加强了用于细胞治疗的替代免疫细胞群的需求。NK细胞,特别是iPSC-NK细胞,具有可靠的安全性,能够用于异体治疗,能够大量生产并储存以制成现成的治疗方法。NK细胞的持久性、靶向肿瘤以及克服免疫检查点的能力等问题仍有待克服。通过基因工程和基因编辑技术,iPSC衍生的NK细胞扩增和靶向的进展有望解决这些问题,并使iPSC衍生的NK细胞更有望成为临床治疗血液学和实体恶性肿瘤的首选。
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